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本产品是专门检测小鼠肝炎病毒的可视化及荧光双染料RT-LMAP试剂盒。

小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus)是一种RNA病毒，主要引起小鼠肝炎。该病是1种特有的传染病，带毒小鼠分布于全世界，但在正常情况下大多呈不显性感染，只在应激因素激发下才能成为致死性疾病，主要为肝炎和脑炎。我国于1979年在裸鼠中发现小鼠肝炎，并分离获得病毒。因此检测小鼠肝炎病毒有重要意义。

1. 即开即用，用户只需要提供病毒RNA样品。
   
2. 恒温扩增，可以不需要荧光PCR等贵重仪器。
   
3. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
   
4. 检测灵敏性一般比RT-PCR高10倍以上，分析灵敏度可以达到100拷贝/反应左右。
   
5. 特异性高，根据小鼠肝炎病毒RNA保守序列设计6条特异引物，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
   
6. 一般35分钟内出结果，比RT-PCR快。
   
7. 提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
   
8. 本产品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
   
9. 上样量大，对20μL的反应体系，最大样品加样量高达到13μL。
   
10. 内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
    
11. 本产品足够50次20μL体系的染料法荧光及可视化RT-LAMP扩增。
    
12. 本产品只可用于科研。

1. 用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
   
2. 如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照(PC)和一个样品制备阴性对照(NC)。PC用10μL本试剂盒提供的阳性对照(1×10⁴拷贝/μL)10μL加一定量的水，使其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致，以此作为PC，NC用水替代。

3. 注意：第一次使用一个新的试剂盒时，必须先将100μL逆转录酶-扩增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix(双染料，待加酶)中，盖上盖子后轻柔颠倒1分钟混匀，然后再取用。
   
4. 反应设置：如果有N+2个RNA纯化样品，需要设置N+4个RT-LAMP扩增，增加RT-LAMP阴性对照和RT-LAMP阳性对照。在N+4个PCR管中加入下列成分：
   

   成分	N+2个 样品管	RT-LAMP 阴性对照	RT-LAMP 阳性对照
   RT-LAMP MasterMix(双染料，已加酶)	各6μL	6μL	6μL
   20×小鼠肝炎病毒RT-LAMP引物混合液	各1μL	1μL	1μL
   N+2个样品RNA	各13μL	-	-
   超纯水	-	13μL	-
   小鼠肝炎病毒RT-LAMP阳性对照(1×104拷贝/μL)	-	-	13μL

   
   
5. 本产品含两种染料，故最好使用荧光PCR仪器进行扩增。设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集SYBR通道的荧光信号。

6. 电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10μL RT-LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。RT-LAMP阳性对照必须有正常RT-LAMP条带(200bp左右的梯形扩增产物)，RT-LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果RT-LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：
   
   
7. 可将光(肉眼)分析：样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈蓝色，样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如果接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见左图(9为阴性，10为阳性)。
   
   
8. 荧光分析(仅限于用qPCR仪进行反应的场景)：样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将有标准的S扩增曲线，样品制备阴性对照和RT-LAMP阴性对照的反应液将没呈平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。
   样品管的荧光曲线为S型，则说明样品为阳性，如果为平线则说明待测样品为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性，右边为阴性。